納米抗體制備由重鏈可變區組成,無輕鏈和復雜的恒定區結構,易于通過基因工程進行改造和表達,可在原核和真核細胞中低成本大規模生產;耐高溫、強酸、強堿等致變性條件,有利于在不同環境下保持活性,便于儲存和運輸。
其CDR3環通常更長,可有效彌補因缺失輕鏈造成的結合界面損失,能更緊密地結合抗原,且不含有多余冗雜結構,僅保留了最關鍵的抗原結合活性部位,并被保守的框架區包圍,形成獨特的凸狀或口袋狀空腔,從而具有高親和力;由于其結構簡單,更容易進行人源化改造,降低免疫原性,提高其在人體中的安全性和有效性。
納米抗體制備的步驟:
-動物免疫:選擇健康的羊駝或駱駝等合適的實驗動物,通常選年輕且免疫系統完好的個體。在實驗前對其進行健康評估,包括體溫、體重、血液學和生化指標檢測等。將目標抗原免疫到動物體內,激發其免疫系統產生對目標抗原特異性的天然抗體。
-獲取抗體基因:從免疫后的動物外周血B淋巴細胞中提取RNA,反轉錄獲取cDNA,以cDNA為底物PCR擴增獲取多樣化納米抗體基因片段。
-構建噬菌體庫:將多樣化納米抗體基因片段連接到噬菌粒上,構建噬菌體庫。
-篩選與驗證:通過噬菌體展示和篩選技術從抗體庫中篩選得到適合的候選納米抗體,并對其進行驗證。
-表達與純化:選擇合適的表達系統,如原核表達系統中的大腸桿菌,或哺乳動物細胞表達系統中的CHO細胞、HEK293細胞等,將表達載體導入相應的細胞中進行納米抗體的表達。之后采用親和純化、尺寸排阻等方法對表達的納米抗體進行純化。